祐全研發中心 產學合作

將祐全牛樟芝菌種分離與鑑定,研究其機能性成分,找出DNA圖譜的規律,得到最佳的免疫調節活性成分比例

工作與研發目標

牛樟芝菌菌種的分離與鑑定

從祐全牛樟芝培養基地之牛樟芝椴木子實體與牛樟芝麥基發酵菌絲體,抽取其特定基因,以生物技術之科學的方法鑑定與分析及基因定序,以做為祐全牛樟芝菌種之身分。

機能性成分分析與控管
牛樟芝子實體與菌絲體最佳組成確認

子實體與菌絲體配方成品與原料之健康食品認證技術製備

牛樟芝菌種的分離與鑑定

牛樟芝子實體與菌絲體配方成品與原料之安全性評估

牛樟芝麥基發酵菌絲體不同批次機能性成分確認

 

調配子實體與菌絲體最佳免疫調解活性成分之組成確認

牛樟芝椴木不同箱子實體不同型態機能性成分確認

牛樟芝椴木不同箱子實體不同型態機能性成分確認

後期功能性評估試驗

牛樟芝菌種鑑定

利用分子方法鑑定牛樟芝椴木子實體之菌種及麥基培養菌絲體之菌種

基因序列

基因序列

此實驗利用5.8S-ITS ITS基因序列作為菌種鑑定,後續將核酸定序資料與GenBank資料庫進行菌種鑑定比對,將樣品分別進行基因體核酸萃取

BLAST系統比對

BLAST系統比對

針對5.8-ITS基因片段設計引子,進行PCR反應,增幅出679 bp核酸片段進行基因片段選殖與定序分析,將定序分析結果與NCBI網站中的BLAST系統做序列比對分析

Experiment Procedure

引子設計與聚合酶連鎖反應

本實驗中針對 5.8S-ITS 基因片段進行引子設計,其序列如下:正向引子 CITS-1 F 5'-gCC gTA ggT gAACCTgCg g,反向引子 CITS-4 R gCC TCC gCT TAT TgA TATgC:預期產物長度為 600~700 bp。

每一次 PCR 反應,內容物包括:5 μl ( 0.2-0.6μg ) 基因體核酸 ( genomic DNA ) 為模版,1 倍 PCR 緩衝液 ( Promega ),2.5 mM 氯化鎂 ( MgCl2 ),0.2 mM 去氣核苷三磷酸 ( dNTPs ),每條引子各 0.8 μM 與0.125 U Taq DNA polymerase ( Progema ),每管總體積為 25 μl,不足補無菌水。由聚合酶鏈鎖反應溫度控制儀 ( Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler,USA ) 完成 PCR 反應,PCR 反應過程分別如下:95°C 變性 ( denaturation ) 30 秒,52°C 煉合 ( annealing ) 45秒,72°C 延展 ( extension ) 30 秒,35 個循環數 ( cycles ):最後以 72 °C 7 分鐘結束反應。

聚合酶連鎖反應產物核酸片段分析

PCR 反應完後以 1.0% TBE 瓊膠電泳分析,內含有 3 μl 溴化乙錠 ( ethidium bromide,EtBr ) ( 0.5μg/ ml ),並以 Gen-100 DNA Ladder  ( GeneMark ) 作為 DNA 長度的判讀標準,來確認產物長度。

取 PCR 反應產物 20 μl 與 4 μl 6X loading dye 混合均勻後,注入瓊脂凝膠的孔 ( well ) 內,取 5 ul的 Gen-100 DNA Ladder ( GeneMark ) 作為 DNA 長度的判讀標準。於 0.5 倍 TBE 電泳緩衝液,以 100 伏特 ( mv ) 電流泳動 35 分鐘,進行電泳分析,電泳完成後,在紫外光透視燈箱 ( UV box ) 上檢視預期產物片段大小,後續將預期片段以解剖刀切下,置入 1.5 ml 離心管中,進行核酸片段膠體純化回收。

基因體核酸萃取

將牛樟芝椴木子實體與麥基培養菌絲體,分別進行基因體核酸萃取,取 100 mg 樣品依照 DNeasy  Plant  Mini  Kit (QIAGEN) 操作步驟, 100 mg 樣品置入研缽中,利用液態氮研磨至粉狀,加入 400μl Buffer API 及 4 μl RNase A 混合,將樣品液轉至一 1.5 ml 離心管,短暫震盪 ( pulse-vortexing ) , 放置 65 度水浴 10 分鐘,再加入 130 μl 的 Buffer AP2,再放置冰上 5 分鐘,取樣品液加入致含有 2 ml 收集管的濾膜離心管 ( QIAshredder Mini spin column )  內,以14000 rpm 離心2分鐘,將過濾之下層液轉至新的 1.5 ml 離心管,加入 1.5 倍體積的 Buffer  AP3/E 後混合,取樣品液 650μl 加入至含有 2ml 收集管的核酸離心管 ( DNeasy Mini spin column ) 內,以 8000 rpm 離心 1 分鐘,更換 2ml 收集管,加入 500μl Buffer AW ( Wash Baffer ),以 14000 rpm 離心 2 分鐘,倒掉 2ml 收集管濾液,此步驟再重複 1 次。將 DNeasy Mini spin column 置換至新的 1.5 ml 離心管中,加入 100μl Buffer AE 至 DN easy Mini spin column 膜中央,於室溫中靜置 5 分鐘,再以 13000 rpm 離心 1 分鐘,丟棄DNeasy Mini spin column,保存 1.5ml 離心管,標示樣品名稱,保存於-20度冰箱中,待後續實驗使用。

聚合酶連鎖反應產物核酸片段萃取分析

利用核酸膠體萃取套組( DNA gel extractionkit,GeneMark,Taiwan ) 回收 DNA 片段。PCR 產物片段利用 1% TBE 膠體電泳分析,並在紫外光下確定 PCR 產物大小後,以解剖刀迅速的將 DNA 片段膠體,置入 1.5 ml 離心管中。加入 500 ul Binding buffer 後放入 56 °C 水浴槽中 10 分鐘使膠體融化成液體為止。再將其液體置入 spin column ( 含收集管 ) 中,以 8,000 rpm 離心 1 分鐘,倒掉收集管內濾液。

後續再加入 700 μl Wash solution,13,000 rpm 離心 1 分鐘,倒掉收集管內濾液。加入 500 μl Wash solution,倒掉收集管內濾液,重複此步驟-次。之後以 13,000 rpm 離心 3 分鐘除去 spin colum 膜中殘餘的酒精。最後將 spin column 轉至新的 1.5 ml 離心管,加入 20 μl 的Elution solution 或是 DDW ( pH7.0-8.5 ) 或 TE buffer,靜置室溫 1 分鐘,再以 13,000 rpm 離心 1分鐘,將 DNA 放置 -20°C 冰箱保存。

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